Zamislite rat u kojem vas je znatno nadmašio neprijatelj koji je krajnje nemilosrdan, a napad na vas je sve što radi. Uvod u neki drugi film Terminator?
Ne, već samo još jedan dan za mikrobe kao što su bakterije i archaea, koje se neprestano suočavaju s napadima virusa i invazivnim nitima nukleinske kiseline poznate kao plazmidi, kojima nikad nema kraja. Kako bi preživjeli tu agresiju, mikrobi su razvili razne obrambene mehanizame, uključujući i tip adaptivnog imunološkog sustava koji se temelji na nukleinskim kiselinama, a koji se vrti oko genetskog elemenata poznatog kao CRISPR, što je kratica za Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats.
Kroz kombinaciju CRISPR i grupu CRISPR povezanih – “Cas” – proteina, mikrobi su sposobni koristiti male prilagođene RNA molekule kako bi utišali kritične dijelove genetske poruke invazivca i steći imunitet za slične invazije u budućnosti. Kako bi bolje razumjeli kako taj imunološki sustav mikroba radi, znanstvenici su trebali proširiti svoje znanje o tome kako se proizvode male RNA molekule prilagođene CRISPR-u. Odgovore je pružio tim istraživača s Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) i University of California (UC) Berkeley.
U studiji koju je vodila biokemičarka Jennifer Doudna, istraživački tim je koristio proteinsku kristalografiju na Berkeley Lab`s Advanced Light Source kako bi proizveli kristalnu strukturu endoribonukleaze pod nazivom “Csy4, na atomskoj razini.” Doudna i njezini kolege identificirali su Csy4 kao enzim u prokariota koji pokreće proizvodnju RNA izvedenih CRISPR-om (crRNAs), male RNA molekule koje ciljaju na i utišavaju invazivne viruse i plazmide.
“Naš model otkriva da Csy4 i srodne endoribonukleaze iz iste CRISPR / Cas potporodice koriste izuzetne mehanizme za prepoznavanje kako bi diskriminirali crRNA-e od drugih staničnih RNA te tako osigurale selektivnu proizvodnju crRNA za stečenu imunost u bakterija”, kaže Doudna. “Također smo otkrili funkcionalne sličnosti između mehanizama za prepoznavanje u RNA te Cys4 i Dicer, enzima koji igraju ključnu ulogu u eukariotskim RNA interferencijama.”
Doudna je vodeći autoritet za molekularne strukture RNA, te održava zajedničke sastanke sa Berkeley Lab`s Physical Biosciences Division i UC Berkeley`s Department of Molecular and Cell Biology and Department of Chemistry. Ona je također i znanstvenica na Howard Hughes Medical Institute (HHMI). Rezultati ovog najnovijeg istraživanja o CRISPR-u ineseni su u časopisu Science u rad pod naslovom “Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.” U radu su surađivali s Doudnaom i Rachel Haurwitz, Martin Jinek, Blake Wiedenheft te Kaihong Zhoua.
CRISPR je jedinica DNA, obično na kromosomu mikroba, koja se sastoji od “ponavljajućih” elemenata, sekvenci parova baza u rasponu od 30 do 60 nukleotida u dužinu, odvojenih s elementima “razdvajačima”, varijablnim sekvencama koje su također duge od 30 do 60 nukleotida. CRISPR jedinice nalaze se u oko 40% svih bakterija čiji je genoma sekvencioniran, te u oko 90% Archaea. Mikrobi možda imaju nekoliko lokusa CRISPR-a unutar svojih genoma te svaki lokus može sadržavati između četiri i 100 CRISPR tih ponavljajućih razdvajajućih jedinica. Doudna i njezini kolege proučavali su CRISPR u Pseudomonas aeruginosa, uobičajene bakterije koja je sveprisutna u okolini. Rachel Haurwitz, studentica u Doudna timu istraživača i prva autorica rada u Science, objašnjava kako CRISPR / Cas imunološki sustav funkcionira.
“Kada bakterija prepozna da je u nju ušao virus ili plazmid, ona ugradi mali komad strane DNA u jednu od svojih CRISPR jedinica kao novu razdvajajuću sekvencu. CRISPR jedinica se potom prepisuje u dugi RNA segment imena pre-crRNA. Csy4 enzim prione uz tu pre-crRNA unutar svakog ponavljajućeg elementa za stvaranje crRNA oko 60 nukleotida duge, koja će sadržavati sekvence koje odgovaraju dijelovima stranih DNA. Cas proteini će koristiti te podudarajuće sekvence kako bi se vezali crRNA na invazivni virus ili plazmid te ga utišali. “
Haurwitz kaže da je CRISPR / CAS sustav za utišavanje strane DNA u prokariota analogan načinu na koji kratke interferencije ili siRNA-e ispravljaju genetske probleme u eukariota. Tijekom vremena, CRISPR / CAS sustav će izgraditi nasljedni DNA kodirani imunitet od budućih invazija od istih vrsta virusa i plazmida. Uz njihov model kristalne strukture enzima Csy4 vezanog na njegovu srodnu RNA, a koji sadrži rezoluciju od 1,8 angstrema, istraživački tim CRISPR Berkeley pokazao je da Csy4 čini specifično sekvencijske interakcije u glavnoj brazdi CRISPR RNA ponavljajuće matične petlje. Zajedno s elektrostatskim kontaktom s fosfatnom osnovom, te interakcije omogućavaju Csy4 da se selektivno veže i prilijepi na pre-crRNA-e pomoću filogenetski sačuvanih ostataka aminokiselina serina i histidina na aktivnom mjestu. “Naš model objašnjava prerađivanje koje je strukturno i sekvencijiski specifično za veliku obitelj CRISPR specifičnih endoribonukleaza”, kaže Doudna.
Doudna i njezini kolege napravili su svoju 1,8 angstromsku rezoluciju kristalografske strukture koristeći eksperimentalne krajeve mjesta linija zraka 8.2.1 i 8.3.1 Beamlines na Berkeley Lab`s Advanced Light Source (ALS). Obje linije su pokretali supravodljivi savitljivi magneti – “supersavitljivi” – te sa značajkama vrhunske nepravilne difrakcije višestrukih valnih duljina (MAD) i mogućnosti makromolekularne kristalografije (MX). Beamline 8.2.1 je dio paketa proteinske kristalografije Beamlines koje obuhvaćaju i Berkeley Center for Structural Biology. “ALS i linije zraka za proteinsku kristalografiju i dalje će biti kritični resursi za naše istraživanje, kaže Doudna. CrRNA-e koje koristi CRISPR / CAS sustav za ciljanu interferenciju stranih DNA udružuje rastuće nizove malih RNA molekula koje posreduju u različitim procesima i u eukariota i u prokariota. Razumijevanje kako ove male RNA molekule rade može poboljšati naše osnovno razumijevanje stanične biologije i dati važne tragove za temeljnu ulogu RNA u evoluciji života.
Doudna kaže, “Ispitivanjem kako bakterije proizvode i koriste male RNA za selektivno ciljanje na gene, nadamo se da ćemo steći uvid u osnovna obilježja puteva koji su se dokazali kao evolucijski korisni za genetsku kontrolu, kako u svijetu bakterija tako i u svijetu eukariota. Trenutno se čini kao da su bakterije i eukarioti evoluirali potpuno različite putove koje RNA-e koriste za regulaciju gena i to je prilično nevjerovatno!”
Izvor: DOE/Lawrence Berkeley National Laboratory
